全文检索
验证码:

  • 报刊名称:《中国蚕业》
  • 主管单位:农业部
  • 主办单位:中国农业科学院蚕业研究所
  • 主编:沈兴家
  • 编辑部主任:窦永群
  • 国际刊号:1007-0982
  • 国内统一刊号:32-1421/S
  • 邮发代号:28-54
  • 刊期:季中月15日
  • 地址:江苏省镇江市四摆渡
  • 邮编:212018
  • 编辑部电话:0511-85616593
  • 电子信箱:zgcye@163.com
  • 银行帐户:中国农业科学院蚕业研究所
  • 开户行:江苏镇江工行大西路分理处
  • 帐号:1104055109000013982

一种家蚕丝腺体外培养和基因瞬时表达分析的方法

【期刊年份】 2018年第04期
【期刊主题】江苏科技大学生物技术学院/江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室
【作者姓名】陈艳花 沈兴家
【作者单位】中国农业科学院蚕业研究所/农业部蚕桑遗传改良重点实验室

摘 要 家蚕是鳞翅目重要的模式生物,但是目前家蚕培养细胞系少,给家蚕基础研究带来不便,也影响了家蚕作为模式生物的应用。组织体外培养在一定程度上可以代表体内环境,且操作相对简单。我们尝试并建立了一种采用TC-100 培养基体外培养丝腺组织的方法,取健康家蚕5 龄2 d 的幼虫,用75%乙醇进行表面消毒,灭菌水冲洗,剪开腹部表皮固定,用镊子轻轻拉出丝腺组织,用75%乙醇快速漂洗、PBS 缓冲液冲洗2 ~ 3 次,放入含有800 μLTC-100 培养基的12 孔细胞培养板的培养孔中,每孔4 条丝腺组织,27 ℃ 培养;将0. 64 μg 增强荧光蛋白基因表达载体pcDNA3.0[ie1egfpSV40]加入到25 μL 不完全TC-100 培养基中孵育15 min 后转染丝腺组织,48 h 后用荧光显微镜观察,培养基清澈,丝腺组织外形完好、发出亮绿色荧光,表明egfp 在丝腺中得到了表达。为进一步验证体外培养丝腺的转染效果,将家蚕miR0031的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)各10 μL 按照同样方法配成转染液,加入到放有丝腺组织的培养孔中,48 h 收集丝腺组织,提取总RNA,荧光定量PCR 检测靶基因BmFibL 的表达量,结果显示,inhibitor 抑制miR-0031的表达,促使BmFib-L 的表达量上升,表明用体外培养丝腺进行转染等试验是可行的。该方法的建立为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制提供新的技术途径,也为家蚕其他组织的体外培养和研究提供借鉴。

关键词 家蚕;丝腺;体外培养;转染;瞬时表达